甲胎蛋白（AFP）的結構功能、異質(zhì)性及配體

甲胎蛋白（AFP）是胚胎血漿中的一種主要大型糖蛋白，屬于白蛋白樣蛋白家族，分子量約為68kDa，由包含590個(gè)氨基酸殘基的單多肽鏈組成。甲胎蛋白由卵黃囊和胎兒肝臟產(chǎn)生。在妊娠12周左右，卵黃囊退化，胎兒肝臟成為AFP合成的主要部位。該蛋白在胎兒體內的濃度很高（1-10mg/mL），但在出生后不久便急劇下降，到產(chǎn)后第二個(gè)月末，僅能檢出微量的AFP，幾乎完全被血清白蛋白所取代。妊娠期間甲胎蛋白含量的變化可用于胎兒異常的檢測，包括唐氏綜合征和神經(jīng)管開(kāi)放性缺陷，如脊柱裂。成人血漿中甲胎蛋白含量的顯著(zhù)增加是肝細胞癌和卵黃囊瘤等幾種病理狀況發(fā)展的標志。

1.AFP的功能

AFP具有多種生物活性，主要包括細胞外轉運功能。它能與雌激素相互作用，對脂肪酸和膽紅素具有高親和力，并能有效結合Cu²⁺和Ni²⁺離子。此外，AFP還參與調節細胞增殖和代謝，與微噬細胞、T淋巴細胞相互作用，抑制母體對胚胎的免疫反應和患者對腫瘤的免疫反應。

2.AFP的結構

2.1AFP的分子形狀

從非晶體狀態(tài)下的原始空間結構來(lái)看，AFP分子成V型不對稱(chēng)結構，含有三個(gè)不同的結構域。分子左下“臂”結構域之間存在多肽連接，這種多肽連接可能充當“鉸鏈”，允許結構域的靈活移動(dòng)，并促進(jìn)潛在配體的結合或釋放。

圖1.AFP的空間結構

注：電子顯微鏡分析人類(lèi)AFP（A）和牛AFP（B）的空間結構。（C,D）為人和牛AFP的反質(zhì)圖。

2.2AFP的結構域

AFP由3個(gè)結構域組成，分別為I、II和III，每個(gè)結構域由大約195個(gè)氨基酸殘基組成。AFP分子的末端部分（總共有420個(gè)氨基酸殘基）被折疊成穩定的獨立結構域，即N端結構域I和C端結構域III，而AFP的中心結構域（由170個(gè)氨基酸殘基組成的結構域II）具有高度的靈活性，容易被胃蛋白酶消化。研究表明，結構域III的氨基酸序列最保守，結構域I的氨基酸序列最不保守。

2.3AFP的分子結構

近紫外CD光譜強度反映了芳香氨基酸殘基結構中的不對稱(chēng)程度，表征了蛋白質(zhì)三級結構。紫外光譜強度的降低通常用于表征蛋白質(zhì)變性過(guò)程中三級結構變化。天然AFP三級結構為相對剛性的不對稱(chēng)結構。不同樣品中AFP的結構特性差異較大，降低pH值，加熱或加入尿素會(huì )導致AFP剛性三級結構變化，如pH3.0，或90℃，或9.5M尿素（圖2A）；配體釋放也會(huì )引起AFP三級結構變化，且釋放天然配體后AFP三級結構幾乎沒(méi)有差異（圖2）。與三級結構不同，AFP二級結構幾乎不受配體含量、配體釋放、以及溶液酸化的影響。

差示掃描微量熱法（DSC）顯示，AFP變性是一個(gè)不可逆的過(guò)程，這可能是由于蛋白質(zhì)變性過(guò)程中不可逆的配體釋放所致（圖3A曲線(xiàn)3）。配體組成的差異（由于分離程序的不同）可能會(huì )極大地影響蛋白質(zhì)的量熱行為，不同樣品中AFP的穩定性和三級結構都存在配體驅動(dòng)差異（圖3B）。不同純化程序導致配體釋放，AFP三級結構發(fā)生改變（圖3B），在某種程度上不同的天然配體含量，可能因分離程序不同而存在差異。蔗糖是AFP的天然配體之一，在蔗糖存在的情況下，熔化過(guò)程更為復雜（圖3C），這表明配體可能在A(yíng)FP空間結構穩定中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。

圖2.AFP的近紫外CD光譜

注：（A）不同實(shí)驗條件下，金屬親和純化AFP的近紫外CD光譜，1、pH7.0、23℃；2、pH3.0， 23℃；3、pH7.0，90℃；4、pH7.0，尿素9.5M。（B）天然配體對甲胎蛋白剛性三級結構的影響。圖中為通過(guò)金屬親和（1）或不同的免疫親和方法（3和4）從人臍帶血清中分離出的蛋白的近紫外CD光譜。圖中也顯示了無(wú)配體（2）和完全未折疊蛋白（5）的光譜以供比較。

圖3.AFP偏摩爾熱容的溫度依賴(lài)性

注：（A）為不同實(shí)驗條件下金屬親和層析分離蛋白的量熱曲線(xiàn)：1、pH7.0；2、pH3.0；3、在pH7.0下對蛋白質(zhì)進(jìn)行重復溫度掃描的結果。（B）為用金屬親和法（1）或兩種不同的免疫親和法（3和4）從人臍帶血清中分離的AFP樣品測得的量熱曲線(xiàn)，也顯示了無(wú)配體形式的熔化（2）。（C）金屬親和純化的AFP在0.2%蔗糖存在下的熔化，虛線(xiàn)表示由量熱曲線(xiàn)分解引起的兩個(gè)簡(jiǎn)單轉變。

2.4AFP的構象穩定性

眾所周知，盡管蛋白質(zhì)具有廣泛的結構空間，但它具有嚴格的構象，在溶液中可以存在多種穩定的有序構象，在一定條件下，多肽鏈可以由有序構象變?yōu)闊o(wú)序構象，反之亦然。這種構象轉變是對外部條件（如溫度、pH值或溶劑組成）變化的反應。

對于A(yíng)FP來(lái)說(shuō)，即使是a.在pH4.5~10.5范圍內；b.尿素濃度低于7.5 M（pH7.5）；c.鹽酸胍濃度低于2.0M（pH7.5）時(shí)，仍然具有較高的構象穩定性。AFP具有極高的構象穩定性很可能是由于大量的二硫鍵（15個(gè)），天然配體顯著(zhù)增加了AFP的穩定性。

2.5AFP變性的不可逆性

研究中顯示，任何一種AFP變性（由pH值降低或溫度升高引起，或由尿素、GdmCl變性引起）都是不可逆的，這種不可逆性是由不可挽回的配體釋放引起的。無(wú)配體的AFP具有致密的二級結構，但沒(méi)有剛性三級結構。

造成AFP重折疊和配體釋放的不可逆性原因可能有兩種。第一種，形成結構的配體結合位點(diǎn)和碳水化合物（糖基化修飾）的附著(zhù)位點(diǎn)，在空間上相對較近。在這種情況下，AFP的寡糖成分可能起到帽子的作用，調節配體進(jìn)出蛋白質(zhì)分子的運動(dòng)（圖4A）。在天然狀態(tài)下，配體結合在A(yíng)FP的疏水性口袋內，并且“門(mén)被糖部分鎖定”（圖4A-1）。在輕度變性條件下，配體可以很容易地從蛋白質(zhì)上去除（圖4A-2）。當變性分子恢復到生理條件時(shí)，它開(kāi)始折疊，碳水化合物與AFP的非共價(jià)相互作用篩選疏水口袋，阻止配體正常滲透到其結合位點(diǎn)（圖4A-3）。

第二種，AFP重折疊和配體釋放的不可逆性可能與非天然AFP分子的自結合有關(guān)（圖4B）。蛋白質(zhì)重折疊常伴有部分折疊的中間體短暫結合。結合或聚集傾向是非天然蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)，即使在天然狀態(tài)下，當濃度足夠高（0.5-1.0mg/mL）時(shí)，AFP也傾向于形成二聚體。因此，人們推測部分折疊的AFP分子自結合（甚至是簡(jiǎn)單的二聚化，如圖4B所示）可以篩選配體結合位點(diǎn)，從而阻止配體與AFP的相互作用。目前，這兩種可能性還有待進(jìn)一步研究。

圖4.AFP中疏水配體釋放不可逆性示意圖

注：（A）糖基化、（B）結合決定的不可逆性。

3.AFP的異質(zhì)性

3.1AFP免疫化學(xué)異質(zhì)性

研究發(fā)現AFP分子上有16個(gè)不同的表位，根據交叉反應性將這些表位分為5個(gè)免疫優(yōu)勢簇（A-E）和7個(gè)單表位。AFP在D簇的可接近性上存在差異，具有開(kāi)放性表位的AFP，D簇與相應的單克隆抗體反應；具有隱性表位的AFP，僅在部分變性后才能與單克隆抗體反應。已知106和108是隱性表位，隱藏表位D、106或108僅在部分AFP分子中表達，106、108和D簇表位的變化，被認為是AFP構象變化的標志。不同來(lái)源AFP中D、106表位表達差異很大。研究顯示，生殖細胞腫瘤患者的血清和肝細胞癌患者的血清中AFP傾向于D-和106-表位形式，羊水AFP傾向于D⁺和106⁺形式。

不同構象的AFP具有相同的分子質(zhì)量和相互轉換的特征。蔗糖可以穩定AFP的天然狀態(tài)，將D⁺、106⁺和108⁺形式的AFP分子幾乎完全轉化為D^-、106^-和108^-變體。在0.2%蔗糖條件下，D⁺和106⁺可以轉化為D^-和106^-。硝基纖維素或塑料吸收AFP，而D^-在硝化纖維素上固定后可以轉化為D⁺，另外添加45%甲醇可增強表位D、106和108的表達。

3.2AFP電荷異質(zhì)性

不同方法分離的AFP樣本通常在免疫上是均勻的，但總存在電荷非均質(zhì)性。在pH值4.5-5.2范圍內，使用等電聚焦法則發(fā)現了9種AFP變體。從人羊水或臍帶血中分離出7種不同電荷形式的AFP，而從不同肝癌來(lái)源分離的AFP比從胎兒組織或羊水分離的AFP表現出更多的電荷異質(zhì)性，此外，新鮮人類(lèi)肝癌AFP樣品在儲存過(guò)程中電荷異質(zhì)性會(huì )增加。

這導致電荷異質(zhì)性的原因可能有三種：氨基酸序列的差異、糖基化或配體結合。同一物種AFP的電荷異質(zhì)性與氨基酸組成的差異無(wú)關(guān)。蛋白質(zhì)碳水化合物成分的差異只能解釋部分電荷差異，因為用神經(jīng)氨酸酶處理AFP可以消除部分異質(zhì)性，因此同一物種中AFP電荷異質(zhì)性主要與配體結合有關(guān)。從人胎兒組織中分離的AFP含有兩種成分，其等電點(diǎn)分別為4.7和5.3。等電點(diǎn)的值取決于天然配體（脂肪酸）的含量，pI4.7的AFP結合脂肪酸，pI5.3成分未結合脂肪。通過(guò)去除脂肪酸，這些異質(zhì)AFP分離物可以轉化為基本均勻的物質(zhì)（pI為5.3）。在非變性條件下，制備的AFP存在多種組分，但在SDS凝膠電泳中AFP通常顯示為單帶。

4.AFP與配體

4.1AFP的配體運輸和釋放

AFP與細胞膜相互作用，由于局部pH值和有效介電常數的降低，細胞膜環(huán)境可能發(fā)生變性。這意味著(zhù)當AFP與膜表面相互作用時(shí)，可能發(fā)生某些蛋白質(zhì)的變性。這種由膜誘導的蛋白質(zhì)轉化為熔融球狀狀態(tài)具有重要的功能，促進(jìn)了跨膜蛋白質(zhì)運輸和毒素滲透到細胞中。

熔融球狀中間態(tài)，是一種致密中間體，它們沒(méi)有剛性的三級結構，但具有類(lèi)似原生的二級結構。剛性天然蛋白分子向熔融球體的結構轉變，可以增加靈活性，促進(jìn)疏水配體的釋放。研究表明，與破壞AFP剛性三級結構的條件不同，要想AFP二級結構重排，致密性發(fā)生改變，需要更高濃度的有機溶劑（如甲醇、三氟乙醇）。

4.2配體對AFP結構的影響

配體在維持AFP的剛性空間結構中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。在無(wú)配體形式下，該蛋白呈現熔融的球狀構象，顯示出緊湊的天然二級結構與缺乏獨特的三維結構組合。熔融球態(tài)的模型是一種“半剛性”分子，它保留了天然折疊模式的主要特征，但具有更大的內部運動(dòng)，包括許多內部側鏈的旋轉異構化。這些特性對于活細胞蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)、細胞器或膜（疏水）環(huán)境中調整自身以適應不同的條件是很有利的。

4.3配體對AFP功能的影響

AFP的空間結構和穩定性對天然配體的存在高度敏感。如前所述，AFP至少有兩種功能，運輸和免疫調節。由于該蛋白具有嚴格的結構與功能關(guān)系，因此認為該蛋白的功能也可能受到配體的調節。關(guān)于A(yíng)FP的主要配體仍有很大爭議，例如肝癌來(lái)源的AFP配體（一種特定脂肪酸）的類(lèi)型和數量都有很大的變化。

配體釋放介導的AFP分子從天然狀態(tài)向熔融球狀狀態(tài)的不可逆構像轉變，可能代表了AFP從無(wú)活性形式到活性（免疫抑制）形式的轉變，這種轉變對免疫調節功能至關(guān)重要。

此外，AFP的體外免疫抑制特性差異很大，而這種變化并不是由糖基化程度引起的，因為同一來(lái)源的AFP變體碳水化合物含量沒(méi)有顯著(zhù)差異。研究發(fā)現，低pH值或高離子強度可以影響AFP生物效力，純化過(guò)程可能會(huì )使AFP變性，發(fā)生不可逆構象轉變，影響其免疫調節活性。

圖5.AFP配體飽和形式轉化為無(wú)配體形式示意圖

注：圖5代表了AFP內吞作用和脂肪酸向靶細胞轉移的雙受體模型。該模型是基于不同細胞對AFP和脂肪酸（FA）攝取的大量研究提出的。根據該模型，細胞表面有兩種不同的受體（AFP-和FA-結合位點(diǎn)）。配體飽和的AFP與相應的受體結合產(chǎn)生內吞作用信號。另一方面，AFP與受體的相互作用使蛋白分子進(jìn)入膜表面輕度變性環(huán)境，蛋白質(zhì)的構象發(fā)生變化，伴隨AFP-FA復合物解離。隨后FA被轉移，與附近的FA受體結合。無(wú)配體的AFP可以與AFP受體分離，也可以通過(guò)內吞作用與脂肪酸一起轉移到細胞中。這種無(wú)配體的熔融球狀AFP可以作為免疫調節劑。

參考文獻

Gillespie JR, Uversky VN. Structure and function of alpha-fetoprotein: a biophysical overview. Biochim Biophys Acta[J]. 2000,1480(1-2):41-56.?

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