甲胎蛋白（AFP）的糖基化及配體結合

甲胎蛋白（AFP）是一種69 kDa的胎兒血清糖蛋白，主要在胎兒肝臟和卵黃囊中合成，半衰期為4-5天。除了妊娠期A(yíng)FP水平較高外，肝癌患者血漿中AFP濃度也較高，被公認為最早發(fā)現的腫瘤標志物之一。越來(lái)越多的證據表明AFP在肝細胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展中起著(zhù)重要的生物學(xué)作用。AFP促進(jìn)HCC細胞增殖、侵襲和轉移，抑制細胞凋亡，增強干性基因的表達。這些惡性功能是通過(guò)cAMP-PKA、RA-RAR、Caspase3、PTEN、PI3K/AKT/mTOR等信號通路激活或抑制下游靶基因表達而實(shí)現的。AFP還具有免疫抑制功能，例如，AFP抑制DC線(xiàn)粒體代謝，誘導DC凋亡，增強NK細胞的細胞毒性，改變CD4⁺/CD8⁺ T細胞的比例，從而抑制T細胞介導的細胞毒性。此外，AFP影響巨噬細胞分化和吞噬活性。AFP通過(guò)參與免疫調節，促進(jìn)HCC細胞的免疫逃逸。

1. AFP的糖基化特征

AFP的糖蛋白變異最初是用神經(jīng)氨酸酶和刀豆蛋白A鑒定和分離的。隨后通過(guò)各種凝集素確定了甲胎蛋白中的糖鏈類(lèi)型，并發(fā)現妊娠和腫瘤發(fā)生期間甲胎蛋白的聚糖組成不同。1990年，研究人員利用氫核磁共振（1H-NMR）技術(shù)成功鑒定了AFP糖肽結構。質(zhì)譜和相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了AFP糖肽類(lèi)型的有效鑒定，促進(jìn)了AFP作為腫瘤標志物的發(fā)展。

1.1 AFP的糖基化修飾位點(diǎn)

N鏈糖基化是一種共翻譯或翻譯后修飾，其中糖鏈連接到特定的天冬酰胺殘基上，具有一致的氨基酸序列N-X-S/T，其中X代表除脯氨酸以外的氨基酸。研究人員在A(yíng)FP的Asn251中檢測到一個(gè)額外的電子密度圖。AFP中N251周?chē)陌被嵝蛄袨門(mén)KVNFTEIQ，符合N-鏈糖基化標準，因此推測這種密度就是糖鏈結構。SDS-PAGE分析觀(guān)察到AFP絲氨酸（N251S）突變成天冬酰胺后具有更高的電泳遷移率（圖1b），表明該突變導致糖基化喪失，降低了AFP的分子量，這進(jìn)一步證實(shí)了該密度為糖基化修飾。

1.2 天然與腫瘤源性AFP的糖基化差異

對正常HEK 293F細胞和肝癌細胞Bel7042提取的AFP（293-AFP和7402-AFP）進(jìn)行糖基化質(zhì)譜分析。結果表明，AFP在殘基N251上的N鏈糖基化組成不同。兩種細胞系AFP的多糖組成均含有濃縮多糖，濃縮多糖的比例均超過(guò)總多糖的75%。這表明來(lái)自?xún)煞N細胞系的AFP都傾向于A(yíng)FP-L3，AFP-L3的特點(diǎn)是在其聚糖鏈的N-乙酰氨基葡萄糖還原端有一個(gè)α-1,6-聚焦殘基。兩種細胞系來(lái)源的AFP主要聚糖組成不同，293-AFP的主要聚糖組成為HexNAc(5)Hex(4)Fuc(1)，占26.82%，而7402-AFP的主要聚糖組成為HexNAc(4)Hex(5)Fuc(1)，占44.44%。

腫瘤源性AFP（tAFP）和臍帶天然AFP（nAFP）糖基化的主要區別在于核心多糖是否與巖藻糖殘基相連，nAFP通常缺乏巖藻糖殘基，但也有特例。AFP聚糖組成的差異可能最終導致功能差異，例如腫瘤源性AFP（tAFP）可直接誘導NK細胞和DC細胞凋亡。

AFP的N-糖基化

圖1. AFP的N-糖基化

注：a.一個(gè)連接到AFP Asn251的附加電子密度圖。密度圖根據AFP子域進(jìn)行顏色編碼，額外電子密度圖用紅色標記。AFP序列符合N鏈糖基化序列模式。b. AFP和突變AFP（N251S）的SDS-PAGE分析。c. AFP的寡糖結構。這種低聚糖被稱(chēng)為β-D-甘露吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖-2-脫氧-β-D-葡萄糖吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖- 2-脫氧-β-D葡萄糖吡喃糖。

2. AFP的金屬離子結合

2.1 金屬離子結合位點(diǎn)

金屬離子通過(guò)參與氧化還原反應、電子轉移、酶催化和蛋白質(zhì)結構穩定等各種過(guò)程，在生物系統中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用。研究人員在A(yíng)FP IA結構域中，發(fā)現了一個(gè)金屬離子結合位點(diǎn)，涉及四個(gè)氨基酸His22、His264、His268和Asp280（圖4a）。有趣的是，金屬離子并非在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中引入的，電子密度圖表明在培養基中就存在A(yíng)FP與金屬離子的結合。

將AFP的4個(gè)氨基酸突變?yōu)楸彼?，得到突變體AFP-4mut（H22A、H264A、H268A和D280A）。在此之后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）評估金屬離子與野生型AFP和突變型AFP-4mut蛋白的結合。結果表明，突變體AFP-4mut中金屬與蛋白質(zhì)的摩爾比降低，特別是鎂、鋁、鎳和鋅等元素（圖2a）。這意味著(zhù)AFP中鑒定的四種氨基酸具有結合不同類(lèi)型金屬離子的能力。

2.2 AFP的金屬離子結合模式

研究發(fā)現，在A(yíng)FP的結構中有一種有趣的金屬離子結合模式，這與Cu、Zn-SOD（PDB：5K02）中觀(guān)察到的一致（圖2）。AFP與Cu，Zn-超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）在結合銅離子和顯示超氧化物歧化酶活性的能力方面具有相似之處。這表明AFP具有多種功能，不僅促進(jìn)金屬離子傳輸，而且還可能與調節血液中氧化還原反應的平衡有關(guān)。

此外，一些金屬元素與AFP的摩爾比超過(guò)1，這表明AFP可能在多個(gè)位置與金屬離子結合。選擇Zn²⁺擬合到密度圖中（圖3a），發(fā)現它與His22、His264、His268和Asp280呈四面體配位（圖2b）。通過(guò)CheckMyMetal服務(wù)器分析鍵長(cháng)和金屬配位（圖2c），鋅離子到3個(gè)氮原子和1個(gè)氧原子的平均距離分別為2.35 ?和2.45 ?。一些參數，如Valence和nVECSUM不理想，可能是由于在該結合位點(diǎn)結合多個(gè)金屬離子。該基序為AFP提供了很強的金屬離子結合能力。His22與Zn²⁺的配位進(jìn)一步穩定了AFP的N端環(huán)結構。胎生動(dòng)物和卵生動(dòng)物AFP的金屬離子結合基序，在序列保守性上存在差異（圖3c）。這表明AFP在金屬離子結合中的功能作用存在潛在的進(jìn)化差異。

先前的研究表明，AFP對Zn²⁺?的親和力高于人血清白蛋白（HSA），這可歸因于結構差異，包括存在參與結合的額外組氨酸殘基。甲胎蛋白是妊娠期間的主要運輸載體。與HSA相比，AFP對金屬離子具有高親和力的一種可能解釋是它需要穿過(guò)胚胎-胎兒屏障。此外，從進(jìn)化的角度來(lái)看，AFP的金屬離子結合基序在胎生動(dòng)物中表現出更大的保守性（圖3c）。與卵生動(dòng)物相比，胎生動(dòng)物的胎兒需要穿過(guò)胎盤(pán)屏障才能從母體獲取必需的營(yíng)養物質(zhì)，因此需要更強的親和力。

金屬離子含量檢測及結構驗證

圖2.金屬離子含量檢測及結構驗證

注：a.用ICP-MS測定AFP中金屬的含量。直方圖的橫軸表示金屬元素。一些含量較低或添加的元素不顯示?？v軸表示金屬與蛋白質(zhì)的摩爾比。AFP-4mut表示四種突變：H22A、H264A、H268A、D280A。AFP-4mut與金屬的摩爾比減小表明金屬與AFP結合。b.描繪Cu、Zn-SOD（5K02，深青色）和AFP（8X1N，粉色）中金屬離子結合位點(diǎn)的原子模型。黃色虛線(xiàn)表示離子到殘留物的距離。c. CheckMyMetal服務(wù)器驗證AFP-Zn²⁺。網(wǎng)站地址：https://cmm.minorlab.org/，PDB代碼：8X1N。

AFP金屬離子結合位點(diǎn)分析

圖3.AFP金屬離子結合位點(diǎn)分析

注：a.甲胎蛋白Zn²⁺和Zn²⁺結合位點(diǎn)的原子模型和低溫電鏡密度。Zn²⁺結合殘基用洋紅色棒狀表示，Zn²⁺用灰色球狀表示。密度用黑色網(wǎng)格表示。b. AFP與HSA中Zn²⁺結合位點(diǎn)的結構比較。AFP（洋紅色）和HSA-Zn²⁺配合物（5IJF，綠黃色）重疊，結構域I對齊。鋅離子為灰色，氧為紅色，氮為深藍色。金屬離子結合位點(diǎn)用黑色三角形表示。不變殘基和高度保守殘基分別用紅色陰影和紅色字母表示。

3. AFP與脂肪酸的結合

在A(yíng)FP模型中，某些區域表現出不同的密度圖，表明是獨立結合的配體，初步推測這些是AFP的天然結合脂肪酸。GC-MS結果表明，與AFP結合的FA中，棕櫚酸（C16:0）含量最多（圖4a），占總FA的57.42%。棕櫚酸的大小與這些密度一致（圖4b）。

3.1 AFP的FA結合位點(diǎn)

FA結合位點(diǎn)分別位于A(yíng)FP亞結構IIA、IIA/IIB、IIIA和IIIB，根據氨基酸序列順序命名為FA結合位點(diǎn)-1/2/3/4。FA在結合位點(diǎn)1處，與AFP的IIA亞結構相互作用。與FA的相互作用主要涉及5個(gè)螺旋氨基酸殘基，FA鏈多被疏水性氨基酸包圍。FA羧基的取向由帶正電的極性氨基酸Lys242和Lys246決定，而His266和Met285則有助于形成s形FA構象。FA結合位點(diǎn)-2位于A(yíng)FP亞結構IIA和IIB之間的界面，位于由四個(gè)α螺旋形成的淺槽內。三個(gè)氨基酸殘基Arg233、Asn348和Gln378作為錨點(diǎn)將FA固定在這個(gè)結合位點(diǎn)上。在FA結合位點(diǎn)3處，FA呈U型彎曲，完全占據AFP亞結構IIIA內的結合袋。在FA下方，Glu474與Arg372、Ser408和Arg500之間形成氫鍵，與其他氨基酸形成半封閉的口袋，這可能是導致FA鏈不能向下延伸的原因。FA的羧酸基團可能與Tyr435、Lys438和Ser513殘基相互作用。FA結合位點(diǎn)-4由橫跨子結構域IIIB的疏水通道形成。FA在袋內呈線(xiàn)性延伸。一些極性氨基酸，包括Tyr425、Tyr426、Asn429和Lys549決定了FA羧基的位置。

3.2 AFP的結合特性

AFP的疏水性分析表明，蛋白質(zhì)的整體外表面是親水的，有利于其存在于血液中。相反，FA結合口袋為疏水表面，使其適合與疏水分子（如FA）相互作用（圖5a）。此外，AFP表面的負電荷比例較高，這有助于其較低的等電點(diǎn)。值得注意的是，大多數帶正電的氨基酸側鏈位于FA結合口袋的入口，特別是精氨酸和賴(lài)氨酸，可能有助于錨定帶負電荷的FA羧基（圖5b）。

此外，使用NanoTemper Tycho NT.6測試蛋白質(zhì)的熱穩定性，發(fā)現脫脂AFP的熱穩定性下降。然而，重新引入FA后，其恢復原有的熱穩定性（圖4c），說(shuō)明FA的結合促進(jìn)了AFP的熱穩定性。

AFP的脂肪酸結合位點(diǎn)

圖4.AFP的脂肪酸結合位點(diǎn)

注：a.AFP中脂肪酸的GC-MS分析。左圖顯示脂肪酸標準品的色譜圖。右圖為從AFP中提取的脂肪酸色譜圖，主要峰為棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）。所有離子均經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜確認。b.AFP中脂肪酸（FA）結合位點(diǎn)的整體和細節特征。左圖顯示了FA在A(yíng)FP結構中的密度圖和原子結構的空間定位。右圖標注了與FA相關(guān)的氨基酸。FA是棕櫚酸（C16:0），呈紫色。c.采用無(wú)標記熱移法檢測AFP的熱穩定性。左圖是在沒(méi)有和存在給定肉豆蔻酸（MYR）的情況下，通過(guò)330 nm熒光發(fā)射得到的甲胎蛋白和脫脂甲胎蛋白的熔化曲線(xiàn)，右圖是這些痕量的一階導數。彎曲溫度（Ti）表示為三個(gè)獨立測量的平均值±SE。

AFP的疏水性和靜電勢面分析

圖5.AFP的疏水性和靜電勢面分析

注：a. AFP中脂肪酸結合袋的疏水性。b. AFP顯示在平面圖中，并根據其庫侖勢著(zhù)色。位于脂肪酸結合袋入口的氨基酸被標記。

眾所周知，甲胎蛋白具有運輸功能，能夠通過(guò)胎盤(pán)將某些營(yíng)養物質(zhì)（FA和金屬離子）從母體血液運輸到胚胎細胞。研究團隊分析了AFP與天然FA結合的結構特征。AFP的FA結合袋不但可以結合FA，也可能與其他小分子配體結合。體內正常細胞通常沒(méi)有AFP受體，胚胎細胞、腫瘤細胞（HCC、乳腺癌、胃癌等）、增殖的肝細胞和一些免疫細胞（如髓源性抑制細胞）等細胞表面具有特異性AFP受體，它們通過(guò)其受體介導的細胞內吞作用消耗AFP。因此，AFP可以作為轉運載體將藥物靶向轉運到腫瘤部位，而不會(huì )損傷正常細胞。計算機輔助對接技術(shù)可用于篩選對AFP結合口袋具有高親和力的藥物，通過(guò)利用AFP腫瘤靶向特性為癌癥治療帶來(lái)潛在的新策略。

參考文獻

Liu K, Wu C, Zhu M, et al. Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites[J]. Commun Biol, 2024,7(1):505.