線(xiàn)性范圍的評估及數據處理方法
實(shí)驗樣本的基本要求和制備方法
基本要求
樣本基質(zhì)應與臨床實(shí)驗樣本相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣本，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣本。進(jìn)行血清學(xué)標志物檢測時(shí)，理想的樣本為分析物濃度接近預期測定上限的混合人血清。
建立一種定量測定方法的線(xiàn)性范圍時(shí)，需在預期測定范圍內選擇7-11個(gè)濃度水平。如將預期測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇更多的濃度水平，然后依據實(shí)驗結果逐漸減少數據點(diǎn)直至表現出線(xiàn)性關(guān)系，可發(fā)現最寬的線(xiàn)性范圍。
當對標稱(chēng)線(xiàn)性參數進(jìn)行驗證時(shí)，需在已知線(xiàn)性范圍內選擇5-7個(gè)濃度水平。
無(wú)論是建立或驗證線(xiàn)性范圍，所選用的濃度水平應可覆蓋整個(gè)預期測定范圍并包括與臨床有關(guān)的重要評價(jià)濃度，如最小測定濃度或線(xiàn)性范圍的最低限、不同的醫學(xué)決定水平、最大測定濃度或線(xiàn)性范圍的高限等。
制備方法
不同濃度水平的樣本可通過(guò)將高濃度樣本與低濃度樣本進(jìn)行倍比稀釋得到，注意在進(jìn)行液體吸取時(shí)應選擇精密度與準確性好的移液裝置。制備時(shí)應將樣本完全混合并避免蒸發(fā)或其他使樣本變質(zhì)的情況。每份樣本的濃度與體積單位應統一。
如果高/低濃度血清的值未知，可將每種血清編碼，用編碼代表每個(gè)血清的相對濃度。對于等濃度間隔樣本，可用連續整數（如1、2、3、4、5）代表連續樣本。進(jìn)行數據處理時(shí)可用樣本號代替X值。表1和表2中描述的樣本制備過(guò)程是按照等濃度間隔的設計進(jìn)行的，每個(gè)濃度水平的樣本量為1.00ml。
表1：11個(gè)濃度水平的樣本制備
| 樣本號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 低濃度血清(ml) | 1.00 | 0.90 | 0.80 | 0.70 | 0.60 | 0.50 |
| 高濃度血清(ml) | 0.00 | 0.10 | 0.20 | 0.30 | 0.40 | 0.50 |
| 樣本號 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 低濃度血清(ml) | 0.40 | 0.30 | 0.20 | 0.10 | 0.00 | |
| 高濃度血清(ml) | 0.60 | 0.70 | 0.80 | 0.90 | 1.00 |
表2：5個(gè)濃度水平的樣本制備
| 樣本號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 低濃度血清(ml) | 1.00 | 0.75 | 0.50 | 0.25 | 0.00 |
| 高濃度血清(ml) | 0.00 | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 |
制備非等濃度間隔的樣本時(shí)應明確各樣本間的濃度關(guān)系，測定時(shí)可以這些樣本間的相對濃度比值做為X值。
樣本的特殊處理：在無(wú)法得到適用的人血清時(shí)，需對樣本進(jìn)行一些特殊處理以滿(mǎn)足實(shí)驗要求。這些處理過(guò)程包括稀釋、加入添加物或透析、熱處理等，無(wú)論進(jìn)行何種處理均應以保持基質(zhì)恒定為基本原則。在評價(jià)報告中應對所使用的稀釋液、添加物、溶劑等的材料來(lái)源加以注明。
樣本稀釋液應選用由廠(chǎng)家推薦或經(jīng)實(shí)驗室證明可使用的產(chǎn)品，如可采用5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。欲提高樣本濃度時(shí)可在樣本中添加分析物純品。在添加物為溶液狀態(tài)時(shí)，應注意添加液體對樣本的稀釋作用（小于10%）并注明所用溶劑。
實(shí)驗過(guò)程
- 建立線(xiàn)性范圍：需測定9-11個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復測定3-4次。
- 驗證標稱(chēng)線(xiàn)性參數：需測定4-6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復測定3-4次。
- 所有樣本應在一次運行中或幾次間隔很短的運行中隨機測定，最好在一天之內完成。
數據處理
數據記錄
可參考下表進(jìn)行數據記錄,也可采用其它形式進(jìn)行記錄，但應注意保留原始數據。
| 項目： | 樣品： | ||||
| 儀器： | 試劑/批號： | 校準品/批號： | |||
| 操作者： | 審核者： | 測定日期： | |||
| 樣本號 | 測定1 | 測定2 | 測定3 | 測定4 | 均值 |
| 1 | |||||
| 2 | |||||
數據可用性檢查
可通過(guò)繪制散點(diǎn)圖對測定數據的可用性進(jìn)行初步檢查。以樣本號或樣本濃度為X軸，以測定結果為Y軸做圖，在圖上標出針對每個(gè)樣本的測定值及每個(gè)濃度水平的測定均值，手工或用計算機做圖將均值點(diǎn)相連，觀(guān)察數據點(diǎn)與直線(xiàn)間的偏差，如偏差過(guò)大，表明數據組存在明顯非線(xiàn)性，需要對測定過(guò)程進(jìn)行檢查，排除因操作錯誤所至誤差，并對樣本進(jìn)行重新測定。如圖形與直線(xiàn)接近，表明可對數據組繼續進(jìn)行統計分析。
剔除離群值
離群值可由散點(diǎn)圖初步判斷，標準中建議采用格拉布斯（GRUBBS）法進(jìn)行離群值檢驗。檢驗步驟如下：
- 1. 每組數據中有4個(gè)測定結果，分別記為 y1，y2，y3，y4。
- 2. 將4個(gè)測定值按大小順序排列，最大值記為max，最小值記為 min;
- 3. 由4個(gè)測定值計算均值y和標準差S：
y=(y1+y2+y3+y4)/4；
- 4. 根據可疑值 max或 min分別按下式計算統計量t：
t1 = (max-)/S，t2 = (min-)/S; - 5. 根據給定的顯著(zhù)性水平a和重復測定次數查表得臨界值，如t值大于臨界值，則相應的可疑值為離群值。
進(jìn)行多項回歸分析
對數據組進(jìn)行多項回歸分析，得到一級、二級與三級多項式。一級多項式為直線(xiàn)，二級多項式表示上升曲線(xiàn)或下降曲線(xiàn)，三級多項式表示S形曲線(xiàn)（在測量范圍兩端具有明顯的非線(xiàn)性）。多項式方程如下：
| 級數 | 多項式 | 回歸自由度（Rdf） |
|---|---|---|
| 一級 | Y = b0 + b1X | 2 |
| 二級 | Y = b0 + b1X + b2X2 | 3 |
| 三級 | Y = b0 + b1X + b2X2 + b3X3 | 4 |
對回歸方程進(jìn)行線(xiàn)性檢驗
多元回歸方程中以bi表示的系數為回歸系數。在二級與三級方程中，b2與b3為非線(xiàn)性系數。對回歸方程進(jìn)行線(xiàn)性檢驗就是對每個(gè)非線(xiàn)性系數作t檢驗，判斷回歸系數與零是否有顯著(zhù)性差異。b0與b1不反映非線(xiàn)性，故不需對其進(jìn)行檢驗。對b2與b3的檢驗方法如下：
計算統計量t，計算公式為：
t = bi/ SEi
式中SEi 為每個(gè)非線(xiàn)性系數的斜率標準誤，計算公式為：
；
；
；
其中，Y為回歸方程預測值，
與
與為測定均值。
由公式df = L*R-Rdf 計算自由度，L為樣本數，R為每個(gè)樣本的測定次數，Rdf為回歸自由度，即回歸方程中系數（包括b0）的個(gè)數。如測定5樣本，每個(gè)樣本重復測定4次，則對測定數據進(jìn)行回歸分析后其三級多項式中L=5，R=4，Rdf=4，df=5*4-4=16。在t值表中尋找t界值（雙邊檢驗，α=0.05），將計算出的t值與界值比較，如p>0.05，表示非線(xiàn)性系數與零無(wú)顯著(zhù)性差異，數據組被認為具線(xiàn)性，此時(shí)可對數據組進(jìn)行精密度檢驗，具體方法見(jiàn)后。當精密度符合線(xiàn)性判斷要求時(shí)，數據分析可結束。如p<0.05，表示此非線(xiàn)性系數具有統計學(xué)顯著(zhù)性，數據組為非線(xiàn)性，此時(shí)應進(jìn)行臨床標準的線(xiàn)性與非線(xiàn)性檢驗。
臨床標準的線(xiàn)性與非線(xiàn)性檢驗
上述多項式回歸分析主要是利用統計學(xué)方法進(jìn)行線(xiàn)性判斷，統計學(xué)標準的線(xiàn)性可稱(chēng)為一階線(xiàn)性，對數據組的要求很高。對于在臨床實(shí)驗室中使用的測定方法，在其臨床應用實(shí)踐中允許有一定的非線(xiàn)性誤差，此時(shí)通過(guò)對統計學(xué)標準的非線(xiàn)性作程度判斷，可得到臨床標準的線(xiàn)性，即二階線(xiàn)性。
臨床標準的線(xiàn)性檢驗中使用了兩個(gè)統計量，ADL（偏離直線(xiàn)平均差異，average deviation from linearity）與PctBnd（百分區界 ，percent bound） ，對于大多數分析物PctBnd取5%。如ADL小于所要求的臨界判斷值，則可認為數據組具有臨床可接受的線(xiàn)性，所擬合出的最適非線(xiàn)性多項式無(wú)臨床意義。
ADL值的計算：
ADL表示最優(yōu)擬合曲線(xiàn)與直線(xiàn)的平均差異，其計算公式如下：
式中p(x)表示最優(yōu)擬合二階或三階方程的擬合值，a+bx表示擬合一階方程的擬合值，L表示樣本數，c表示總平均濃度（全部測量數據的平均值）。
將ADL與臨界值比較
一般設定ADL小于5%為臨床允許誤差，即取PctBnd為5%，通過(guò)查表（見(jiàn)附表A與B）得到ADL臨界值。如ADL小于臨界值，可認為多項式具有臨床可接受的非線(xiàn)性，為二階線(xiàn)性。如ADL大于臨界值，則為臨床不可接受的非線(xiàn)性。
對數據組進(jìn)行精密度檢驗
測量數據的精密度可直接影響多項式回歸分析的結果，為提高統計功效，需對數據組進(jìn)行精密度檢驗。
計算最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤（σ）
式中yi表示各個(gè)測量值，p(xi)表示最優(yōu)擬合方程的擬合值，n表示樣本數乘以重復次數(L x R)，d表示最優(yōu)擬合方程的階數。
計算不精密度
用最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤（σ）與總平均濃度(
)的百分比代表不精密度。
數據組的不精密度檢驗
跟據以下公式進(jìn)行判斷：
式中σ表示最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤，表示總平均濃度，L表示樣本數，R表示重復測量的次數，C表示常數(附表C)，PctBnd：取5%。
不精密度滿(mǎn)足判斷式時(shí)， 說(shuō)明數據的精密度好可作線(xiàn)性評價(jià)。反之則表示數據的精密度差，不能作線(xiàn)性評價(jià)。當PctBnd取5%時(shí)， 尚可通過(guò)查不精密度和臨界值表判斷數據是否精密 (附表A和B)， 如此時(shí)不精密度對應的臨界值顯示P， 表明測量數據的精密度不符合作線(xiàn)性判斷的要求。
結果報告
線(xiàn)性范圍報告的具體格式不要求，但至少應包括以下幾方面：
進(jìn)行線(xiàn)性評價(jià)的實(shí)驗室或生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng)。
被評價(jià)的方法或試劑名稱(chēng)，批號。
測定項目。
線(xiàn)性范圍（如為二階線(xiàn)性應包括臨床允許誤差）。
如可能應標出測定項目的醫學(xué)決定水平及在此水平處的臨床允許誤差。
附錄：
表A：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=1或2階）
| σ/% | L*R=10 | L*R=12 | L*R=14 | L*R=16 | L*R=18 | L*R=20 |
| 1 | 5.5 | 5.5 | 5.4 | 5.4 | 5.4 | 5.4 |
| 2 | 6.1 | 6.0 | 5.9 | 5.8 | 5.8 | 5.7 |
| 3 | 6.6 | 6.4 | 6.3 | 6.3 | 6.2 | 6.1 |
| 4 | 7.1 | 6.9 | 6.8 | 6.7 | 6.6 | 6.5 |
| 5 | 6.6 | 7.4 | 7.2 | 7.1 | 7．0 | 6.9 |
| 6 | 8.2 | 7.9 | 7.7 | 7.5 | 7.4 | 7.2 |
| 7 | 8.7(P) | 8.4(P) | 8.1 | 7.9 | 7.8 | 7.6 |
| 8 | P | P | 8.6(P) | 8.3(P) | 8.1 | 8.0 |
| 9 | P | P | P | P | 8.5(P) | 8.3(P) |
| >9 | P | P | P | P | P | P |
L*R：樣本數*重復測量的次數
表B：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=3階）
| σ/% | L*R=10 | L*R=12 | L*R=14 | L*R=16 | L*R=18 | L*R=20 |
| 1 | 5.5 | 5.5 | 5.4 | 5.4 | 5.4 | 5.4 |
| 2 | 6.1 | 6.0 | 5.9 | 5.9 | 5.8 | 5.8 |
| 3 | 6.7 | 6.5 | 6.4 | 6.3 | 6.2 | 6.2 |
| 4 | 7.2 | 7.0 | 6.9 | 6.8 | 6.7 | 6.6 |
| 5 | 7.8 | 7.6 | 7.4 | 7.2 | 7.1 | 7.0 |
| 6 | 8.4 | 8.1 | 7.9 | 7.7 | 7.5 | 7.4 |
| 7 | 9.0(P) | 8.7(P) | 8.4 | 8.2 | 8.0 | 7.8 |
| 8 | P | P | 8.9(P) | 8.6(P) | 8.4 | 8.2 |
| 9 | P | P | P | P | 8.9(P) | 8.7(P) |
| >9 | P | P | P | P | P | P |
L*R：樣本數*重復測量的次數
表C：不精密度界值的常數
| 最優(yōu)擬合方程的階數 | 精密度界值的常數（C） |
| 一階或二階 | 6.3 |
| 三階 | 6.5 |
相關(guān)產(chǎn)品
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