RT-qPCR檢測原理
逆轉錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）將逆轉錄反應（RT）與實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈式反應（qPCR）相結合，是當下病原學(xué)分子診斷的常用方法。RT-qPCR以RNA為起始材料，在RT階段，運用逆轉錄酶以RNA為模板形成互補的DNA鏈（cDNA）。隨后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應用中，其中包括病原體檢測、基因測試、疾病研究和基因表達分析。
1.RT-qPCR的一步法與兩步法
1）一步法：將逆轉錄與PCR擴增結合在一起，使逆轉錄酶與DNA聚合酶在同一管內同樣緩沖液條件下完成反應。由于兩步反應都在一個(gè)管中完成，因此該方法具有更少的實(shí)驗誤差和移液步驟，減少污染的風(fēng)險。
2）兩步法：將逆轉錄和PCR擴增過(guò)程分開(kāi)，在兩個(gè)管中完成檢測。需要使用不同的緩沖液、反應條件、以及引物設計策略。由于反應分步進(jìn)行，能夠優(yōu)化單一反應過(guò)程的反應緩沖液和反應條件，可建立長(cháng)期保存，并用于多次反應的穩定cDNA庫。
| 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | |
| 一步法 | 更少的實(shí)驗誤差 | 無(wú)法分別對兩步反應進(jìn)行優(yōu)化 |
| 減少污染風(fēng)險 | 減少污染風(fēng)險 | |
| 可進(jìn)行高通量擴增或篩選 | 可進(jìn)行高通量擴增或篩選 | |
| 兩步法 | cDNA可保存并用于多次反應 | 污染風(fēng)險增加 |
| 優(yōu)化單一反應條件和緩沖液 | 操作復雜，實(shí)驗誤差增大 | |
| 靈敏度高 | 需要進(jìn)行更多的優(yōu)化 |
表1. 一步法與兩步法對比
2.RT階段
RNA是逆轉錄的模板。根據來(lái)源材料的類(lèi)型和實(shí)驗目標，有多種方法可進(jìn)行RNA的提取。較常用的有Trizol法、離心柱法和磁珠法。在RT階段，引物在退火時(shí)與單鏈RNA結合，提供給逆轉錄酶一個(gè)用于合成的起點(diǎn)位置。逆轉錄酶利用RNA合成cDNA，得到穩定的RNA-DNA雜交鏈。
引物可分為三種引物Oligo引物（dT）、隨機引物和序列特異性引物。Oligo引物（dT）包含錨定位點(diǎn)，確保引物結合至mRNA 3'端poly(A）尾部。隨機引物長(cháng)度6-9個(gè)堿基，在RNA轉錄過(guò)程中，可退火至多個(gè)位點(diǎn)，提高cDNA產(chǎn)量。序列特異性引物是靶向特異的RNA序列的定制引物，可產(chǎn)出特異的cDNA庫。通常情況下將Oligo引物與隨機引物混合使用為逆轉錄酶提供結合位點(diǎn)。當檢測RNA病毒時(shí)需要使用序列特異性引物，結合在靶標序列上。
逆轉錄酶需要具有較高熱穩定性和較低核糖核酸酶H（RNase H）活性。較高熱穩定性可以保證逆轉錄酶在整個(gè)反應中的活性來(lái)獲得更高的 cDNA 產(chǎn)量，減少非特異性擴增。較低的RNase H活性可以減少RNA的降解來(lái)避免截短cDNA。
3.qPCR階段
1）染料法：加入一對引物和SYBR GreenⅠ熒光染料。退火階段，引物特異性結合在兩條鏈上，為DNA聚合酶提供結合位點(diǎn)。SYBR GreenⅠ熒光染料是一種DNA雙鏈小溝結合染料，DNA聚合酶延伸引物，形成雙鏈，染料結合于雙鏈小溝中發(fā)出熒光。反應體系內雙鏈DNA濃度越高熒光信號越強。由于染料法無(wú)法在同一個(gè)反應中檢測多個(gè)目的片段，還會(huì )受到引物二聚體的影響。在這種情況下，需要進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，判斷擴增所得產(chǎn)物是否只有一種。
圖1. 染料法發(fā)光原理
2）探針?lè )ǎ簩晒馊玖咸鎿Q為一條Taq Man探針。探針具有與靶標互補的序列，5'端標記一個(gè)熒光報告基團，3'端標記一個(gè)熒光淬滅基團，當探針完整時(shí)，熒光信號會(huì )被淬滅基團吸收。退火階段，探針特異性結合到靶標序列上，DNA聚合酶沿5'-3'方向合成新鏈直至探針 5'端時(shí)，聚合酶水解探針，使熒光報告基團與淬滅基團分離，產(chǎn)生熒光。3'端淬滅基團阻止探針被DNA聚合酶擴增。Taq Man探針結合的目標越多，熒光信號越強。理論上，探針?lè )ㄖ械臒晒庵粊?lái)源于靶標，也就是不受非特異性擴增和引物二聚體影響。
圖2. 探針?lè )òl(fā)光原理
4.結果分析
1）熔解曲線(xiàn)：當擴增完成后，對反應體系進(jìn)行升溫檢測，同時(shí)監測熒光信號。當到達某一溫度后，雙鏈DNA迅速解鏈，熒光信號驟降。當信號達到最低時(shí)，即可獲得熒光信號強度隨溫度變化的原始圖譜。對原始圖譜進(jìn)行負導數轉換，繪制熒光信號變化與溫度的關(guān)系圖，圖中峰值對應的溫度即為T(mén)m值?；赥m值的差異，便可區分產(chǎn)物。
熔解曲線(xiàn)一般用于染料法，出現單峰說(shuō)明擴增產(chǎn)物特異性好；出現雜峰特異性差，存在非特異性擴增。若熔解曲線(xiàn)只有單峰且對應溫度是退火溫度則是靶標發(fā)出的熒光，實(shí)驗結果有效。
圖3. 染料法熔解曲線(xiàn)
2）擴增曲線(xiàn)：將已知濃度的靶標稀釋幾個(gè)數量級后進(jìn)行qPCR反應循環(huán)擴增，并用產(chǎn)生的熒光信號與相應濃度生成標準曲線(xiàn)。將未知樣本的Ct值與該標準曲線(xiàn)進(jìn)行比對，可以確定其濃度。
熒光閾值是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標準差的10倍（熒光閾值要設定在PCR擴增的指數期）。qPCR的擴增曲線(xiàn)與熒光閾值交點(diǎn)對應的橫坐標就是循環(huán)數（Ct）值。Ct值越低證明樣本中靶標越多。從qPCR的曲線(xiàn)中可以看出，在基線(xiàn)期，沒(méi)有明顯的熒光信號。隨著(zhù)循環(huán)數的增加，熒光信號逐漸增強。在平臺期，因酶活降低或dNTP被消耗殆盡，曲線(xiàn)趨于平緩。
圖4. qPCR擴增曲線(xiàn)
參考文獻
[1]Green M R, Joseph S. Quantification of RNA by Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)[J]. Cold Spring Harbor protocols, 2019.
[2]Hawkins S, Guest P C. Multiplex Analyses Using Real-Time Quantitative PCR[J]. Springer New York, 2017.
[3]Nayar G, Seabolt E, Kunitomi M, et al. Analysis and Forecasting of Global RT-PCR Primers for SARS-CoV-2[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1).
[4]Kulesh D A, Loveless B M, Norwood D, et al. Monkeypox virus detection in rodents using real-time 3'-minor groove binder TaqMan assays on the Roche LightCycler.[J]. Laboratory Investigation, 2004, 84(9): 1200-1208.
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