電化學(xué)發(fā)光免疫分析機理及其應用
電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種集電子發(fā)光技術(shù)、納米微粒子技術(shù)、生物素-親和素系統、抗原-抗體免疫反應、電磁場(chǎng)分離整合為一體的自動(dòng)化標記免疫分析系統，是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定的結合。ECLIA常用磁珠微球作為固相載體，三聯(lián)吡啶釕[ Ru（bpy）3]2+作為發(fā)光物質(zhì)，由電極激發(fā)，在三丙胺參與下迅速穩定發(fā)光，使檢測結果穩定可靠，其精密度、準確度均優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。ECLIA既具有發(fā)光檢測的高度靈敏性， 又具有免疫分析的高度特異性， 整個(gè)反應過(guò)程在全自動(dòng)化封閉體系中進(jìn)行，無(wú)人為操作誤差影響。ECLIA具有無(wú)放射性、靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、操作簡(jiǎn)單、易標記、可實(shí)現在線(xiàn)分析等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，并且適用于對生物組織、體液等復雜生物樣品中極低含量的生化物質(zhì)及藥物分析，因此在免疫分析研究中發(fā)揮著(zhù)越來(lái)越重要的作用。
ECLIA與其他幾種標記技術(shù)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)：
1）無(wú)放射性輻射危害，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應；
2）靈敏度高，檢測線(xiàn)性范圍在6個(gè)數量級，下限值為1pmol，達到或超過(guò)放射免疫分析（RIA）水平；
3）檢測速度快，僅需幾分鐘到十幾分鐘；
4）穩定性好，自動(dòng)化程度高，可直接使用液體試劑；
5）應用范圍寬，既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原、抗體，又可用于核酸探針檢測。
1.電化學(xué)發(fā)光原理
電化學(xué)發(fā)光免疫分析包括了電化學(xué)反應和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+作為標記物，有標記物的生物分子與配體發(fā)生特異的結合反應后，進(jìn)入流動(dòng)測量室，此時(shí)電發(fā)光過(guò)程被啟動(dòng)。
1）電化學(xué)反應過(guò)程：在一定的電壓作用下，[Ru（bpy）3]2+釋放電子成為[Ru（bpy）3]3+，同時(shí)電極表面的三丙胺（TPA）也釋放電子成為陽(yáng)離子自由基 TPA+，并迅速自發(fā)脫去一個(gè)質(zhì)子而形成三丙胺自由基TPA·；
2）化學(xué)發(fā)光過(guò)程：具有強氧化性的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]3+和具有強還原性的三丙胺自由基TPA·發(fā)生氧化還原反應，結果使[Ru（bpy）3]3+還原成激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+*，然后它以熒光機制衰變釋放出一個(gè)波長(cháng)為620nm光子的能量，而成為基態(tài)的[Ru（bpy）3]2+；
3）上述化學(xué)發(fā)光過(guò)程后，反應體系中仍存在二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+和三丙胺（TPA），電極表面的電化學(xué)反應和化學(xué)發(fā)光過(guò)程可以循環(huán)進(jìn)行。通過(guò)上述的循環(huán)過(guò)程，測定信號不斷地放大，檢測靈敏度大大提高，故電化學(xué)發(fā)光檢測具有高靈敏的特點(diǎn)；
4）上述的電化學(xué)發(fā)光過(guò)程產(chǎn)生光信號的強度與[Ru（bpy）3]2+的濃度成線(xiàn)性關(guān)系。將[Ru （bpy）3]2+與免疫反應體系中的一種物質(zhì)結合，經(jīng)免疫反應、分離后，檢測免疫反應體系中剩余二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+經(jīng)上述過(guò)程后所發(fā)出的光，即可得知待檢物的濃度。
2.電化學(xué)發(fā)光體系
1）Ru（bpy）3+和Ru（bpy）33+的湮滅ECL
通過(guò)階越脈沖電位法改變電極電位產(chǎn)生氧化態(tài)Ru（bpy）33+和還原態(tài)Ru（bpy）3+，這兩種物質(zhì)經(jīng)過(guò)擴散相互接觸之后，發(fā)生氧化還原反應，生成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，Ru（bpy）32+*衰減回落至基態(tài)產(chǎn)生ECL。整個(gè)過(guò)程遵循單重態(tài)電化學(xué)發(fā)光路徑（S-route）。
Fig.1 湮滅ECL反應過(guò)程
2）還原氧化型ECL
當電極施加一個(gè)合適的還原電位時(shí)，Ru（bpy）32+被還原成Ru（bpy）3+，同時(shí)另一共反應物如過(guò)硫酸根離子（S2O82-）被還原形成具有強氧化能力的中間體，該中間體可將Ru（bpy）3+氧化產(chǎn)生激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，引發(fā)ECL。
Fig.2 還原氧化型ECL反應過(guò)程
早期對氧化還原型電化學(xué)發(fā)光反應的研究?jì)H限于有機相，因為在較低還原電位的作用下，常用金屬電極在水溶液中的析氫現象嚴重制約了Ru（bpy）32+-SO4-體系，拓展了水溶液中還原氧化型電化學(xué)發(fā)光反應的應用與研究。
3）氧化還原型ECL
與還原氧化反應相反，當在電極上施加一個(gè)合適的氧化電位時(shí)，Ru（bpy）32+在電極表面被氧化產(chǎn)生Ru（bpy）33+，它可和溶液中的其他還原劑反應得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，從而產(chǎn)生ECL。目前研究較充分且應用廣泛的還原劑是三丙胺（TPrA），它與三聯(lián)吡啶釕氧化還原電化學(xué)發(fā)光的機理主要有以下三種：
① Ru（bpy）32+在電極表面被氧化形成Ru（bpy）33+，而TPrA在電極表面被氧化生成TPrA+·，它脫去質(zhì)子形成強還原性的TPrA·后，TPrA·可將Ru（bpy）33+還原得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，產(chǎn)生ECL。
② 具有強還原性的TPrA·不僅可以還原Ru（bpy）33+，同時(shí)還可還原溶液中Ru（bpy）32+產(chǎn)生Ru（bpy）3+，而Ru（bpy）3+又可以和Ru（bpy）33+通過(guò)湮滅機理產(chǎn)生ECL
③ 當TPrA濃度遠大于Ru（bpy）32+時(shí)（約104-105倍過(guò)量），僅在0.9V的氧化電位下就可觀(guān)察到ECL。TPrA在電極上失去一個(gè)電子形成具有一定氧化能力的TPrA+，TPrA+一方面可轉變?yōu)門(mén)PrA·并與Ru（bpy）32+反應生成Ru（bpy）3+；另一方面TPrA+又可充當氧化劑，把生成的Ru（bpy）3+氧化為激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）32+*從而產(chǎn)生ECL。
Fig.3 還原氧化型ECL的三種反應過(guò)程
4）溶解氧陰極電化學(xué)發(fā)光反應機理
基于水溶液中氧氣還原的陰極電化學(xué)發(fā)光機理是與以上介紹的湮滅電化學(xué)發(fā)光反應機理、還原氧化型和氧化還原型電化學(xué)發(fā)光反應機理完全不同的，因為陰極電化學(xué)發(fā)光反應并不涉及Ru（bpy）32+在電極上的直接氧化，而電極反應主要是水溶液中氧氣的還原，還原產(chǎn)物為強氧化性物質(zhì)，這些物質(zhì)可使溶液中Ru（bpy）32+氧化變?yōu)镽u（bpy）33+，并且最終通過(guò)湮滅反應形成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，產(chǎn)生ECL信號。
3.ECLIA在醫學(xué)檢測中的應用
1）傳染疾病病原體診斷
目前大多數實(shí)驗室采用ELISA和膠體金法對病原體進(jìn)行檢測，但對于低濃度樣本，檢測時(shí)常因方法學(xué)的原因造成靈敏度低，導致臨床出現漏檢，并且由于影響檢測的因素較多，尤其是灰區附近的樣本測定結果差異大，導致重復性差。膠體金雖然操作簡(jiǎn)單，但靈敏度較低，臨床漏檢率相對較高。以艾滋?。℉IV）檢測為例，國內HIV感染的臨床診斷以血清病毒抗體檢測為主，運用ECLIA測定血清HIV的整個(gè)檢測過(guò)程中是在封閉流動(dòng)系統中進(jìn)行，極大地降低了交叉污染，測定結果不僅快速、準確、可靠，完成單個(gè)樣品分析時(shí)間也大大縮短，且特異性、精密度均優(yōu)于ELISA并克服了鉤狀效應等假陰性現象，可批量上機進(jìn)行自動(dòng)化分析。
2）蛋白質(zhì)和激素檢測
目前激素的檢測多為RIA與ELISA，前者會(huì )造成生物損害及環(huán)境污染，后者的反應底物具有毒性且檢測結果受溫度和pH值的影響較大。用ECLIA替代RIA與ELISA可在避免上述危害的同時(shí)給臨床診斷、治療和預后提供可靠的實(shí)驗數據。ECLIA可對甲狀腺激素、性激素等多種激素進(jìn)行測定，以糖尿病中的胰島素為例，ECLIA可動(dòng)態(tài)檢測低濃度范圍的胰島素水平，相較于其他方法來(lái)說(shuō)ECLIA是一種非常靈敏可信且沒(méi)有放射污染的均質(zhì)分析方法。
ECLIA測定血清肌酸激酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白和地高辛等，有利于診斷早期心肌梗死等心肌損傷性疾??；檢測黃體生成素、促卵泡生成素、雌二醇、孕酮、催乳素、睪酮等，可利于診斷早期生殖系統疾??；檢測胰島素、胰島素樣生長(cháng)因子，有利于糖尿病早期診斷；還可用于血清T3、T4、FT3、FT4等甲狀腺激素的測定。
3）腫瘤診斷
隨著(zhù)腫瘤基礎理論的發(fā)展，新檢測手段和技術(shù)大量涌現。腫瘤標志物在腫瘤診治中的重要作用已被學(xué)術(shù)界所公認，目前主要用于腫瘤的早期發(fā)現，如前列腺特異性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）能用于普查無(wú)癥狀的腫瘤病人、腫瘤的鑒別診斷與分期、預后判斷、療效觀(guān)測與判別復發(fā)的指標。ECLIA因其出色的靈敏度與無(wú)放射性污染在腫瘤標志物檢測中逐步取代其它檢測方法。
ECLIA可對良性及惡性腫瘤患者進(jìn)行體外早期輔助診斷，可以免除腫瘤介入檢查的高費用，同時(shí)還可針對檢測血中的癌胚抗原和腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原進(jìn)行結腸癌、胃癌、胰腺癌等消化系統及卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌等婦科癌癥的診斷。此外ECLIA還可檢測血清HCG，適用于早孕和宮外孕診斷。
4）檢測細胞因子及基因
體內細胞因子種類(lèi)繁多，但含量均較少，常規檢測方法難以得到準確結果，運用ECLIA可以很好的解決這一不足。ECLIA可用于測定腦內衍生神經(jīng)營(yíng)養因子（BDNF）、神經(jīng)營(yíng)養因子（TNF），也可用于測定T細胞中γ-干擾素水平及血清、細胞培養液中多種白細胞介素的含量。
參考文獻
[1]李海娟, 韓雙, 胡連哲,等. 聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(11): 9.
[2]董偉. 新型的電化學(xué)發(fā)光免疫分析及其臨床應用[J]. 標記免疫分析與臨床, 2001, 8(1): 3.
[3]Ming Zhou, Lingnuo Li, Nianping Dan. Enhanced electrochemiluminescence immunoassay: 1. Wisely using an electronically neutral ruthenium complex luminophore[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2022, 919(116511): 1572-6657.
相關(guān)產(chǎn)品
蘇公網(wǎng)安備32011202001302