糖化血紅蛋白（HbA1c）的檢測方法

全球糖尿?。―M）患病率很高，是嚴重威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛生問(wèn)題，DM的防治一直是醫學(xué)研究的熱點(diǎn)。傳統的DM診斷和治療檢測采用空腹血糖（FBG）、餐后血糖（OBG）和口服葡萄糖耐量實(shí)驗（OGTT）等，但是血糖參數僅代表抽血時(shí)的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（GHb）作為反映長(cháng)期血糖水平的金標準，也是檢測DM治療的重要指標。1985年Allen等報告用陽(yáng)離子交換層析儀把人類(lèi)HbA分離成至少3種比HbA帶更多陰電荷的較小成分，按照從柱中洗滌出來(lái)的順序先后把它們分別稱(chēng)為HbA1a、HbA1b和HbA1c。但當時(shí)并沒(méi)有發(fā)現這些成分與DM之間的關(guān)系。直到1975年，人們才逐漸認識到HbA1c來(lái)源于葡萄糖結合經(jīng)翻譯修飾后的HbA，以及HbA1c與FBG、葡萄糖耐量試驗中的葡萄糖峰值以及曲線(xiàn)下面積、過(guò)去數周的平均血糖水平等之間的密切關(guān)系。

臨床實(shí)驗室常用的HbA1c分析方法分為兩大類(lèi)：一類(lèi)基于HbA1c和非HbA1c所帶的電荷不同，包括陽(yáng)離子交換層析法。電泳法和等電位聚焦法；另一類(lèi)基于GHb基團結構不同，包括親和層析法和免疫學(xué)方法。

1. 乳膠凝集反應法

乳膠凝集反應法是利用糖化血紅蛋白（HbA1c）抗原與HbA1c抗體直接測定總血紅蛋白Hb中的糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量。目前國內外幾家廠(chǎng)商可以提供HbA1c測定的試劑盒。這種免疫反應是由被測血樣品種的總Hb和HbA1c與試劑中的HbA1c抗體結合而形成凝集，凝集量隨HbA1c蛋白濃度的大小而變化。用生物分析儀器來(lái)進(jìn)行比濁測定HbA1c抗原的濃度，采用終點(diǎn)法，生化儀通過(guò)測定反應液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出HbA1c占Hb的百分含量，測定時(shí)，儀器多采用660nm單色光做主波長(cháng)，800nm單色光做副波長(cháng)，通過(guò)標準曲線(xiàn)得出實(shí)測值。由于這種試驗其標準曲線(xiàn)是非線(xiàn)性的，所以在測定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5種不同濃度的定標液，做出5點(diǎn)非線(xiàn)性標準曲線(xiàn)。曲線(xiàn)和數值存在生化儀的貯存器中，測定樣品時(shí)，實(shí)測出的吸光度值A與標準曲線(xiàn)比較，由儀器CPU求出實(shí)測樣品中的HbA1c百分含量。乳膠凝集反應法測定HbA1c方便、不用增加儀器，可直接用自動(dòng)生化分析對樣品進(jìn)行快速測定。該方法也可以用手工的方法，在酶標儀進(jìn)行測定，是目前使用較多的方法。但乳膠凝集反應法其準確性和重復性均有欠缺。

2. 離子交換高壓液相色譜法HPLC

使用離子交換高壓液相色譜HPLC（high pressure liquid chromatography）來(lái)測定糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量目前被認為是分析HbA1c的金標準。采用HPLC方法工作的全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀器，儀器快速、簡(jiǎn)便、精巧、準確等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多用戶(hù)的歡迎。

色譜分析是一類(lèi)利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質(zhì)相對運動(dòng)過(guò)程中，將混合物中的各種成分分離開(kāi)的一種分析技術(shù)。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液相的色譜法的總稱(chēng)。色譜法又叫色層或層析，這一技術(shù)在生命科學(xué)研究中用于生物活性物質(zhì)的分析；生物活性物質(zhì)是以混合物形式存在，人類(lèi)血液中的蛋白質(zhì)有上千種，只有把混在一起的被測蛋白分離出來(lái)，才能準確測定；在HbA1c的測定時(shí)，可以通過(guò)高精度HPLC，將HbA1c從Hb中分離出來(lái)，才能得到準確的數值。在生命科學(xué)研究中，活性物質(zhì)的分離主要應用的是液相色譜。

3. 糖化血紅蛋白自動(dòng)分析儀

糖化血紅蛋白自動(dòng)分析儀采用離子交換HPLC法測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。離子交換HPLC法，是利用能交換離子的材料為固定相來(lái)分離離子型化合物的方法。儀器使用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行HbA1c的百分比測定；當一定量的全血樣品被取樣針吸入到進(jìn)樣裝置內，在稀釋部分被溶血釋放出紅細胞中的血紅蛋白Hb，并由稀釋液稀釋?zhuān)♂尯玫囊呀?jīng)溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。柱內的固定相是最新研發(fā)的非多孔性、不溶和可滲透的交聯(lián)高聚物，上面分布固定的帶電荷基團和能游走的配衡離子；樣品通過(guò)過(guò)濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液（流動(dòng)相）洗脫，使樣品向下移動(dòng)。此時(shí)溶液中所含血紅蛋白Hb的各種組分即與固定相上能移動(dòng)的離子進(jìn)行交換，樣品中的血紅蛋白多種組分在固定相上連續進(jìn)行可逆的交換吸附和解吸作用，而3種不同離子濃度的鹽液，形成線(xiàn)性梯度洗脫。全自動(dòng)血紅蛋白分析儀能在1分多鐘內，將Hb中的多種成分分離，其中HbA1c、HbF、HbA1被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb成分到達儀器的檢測器，檢測器內裝有發(fā)射單色光的發(fā)光二極管，通過(guò)雙波長(cháng)可見(jiàn)光比色法測定HbA1c、HbF、HbA1三個(gè)參數。儀器的檢測器檢測出分離后HbA1c、HbF、HbA1組分的吸光度值，與HbA1c標準品吸光度值比較，分析計算出結果，最后以百分率表示的Hb組分結果與色譜圖一起打印出來(lái)。

離子交換柱HPLC法對全血直接測定HbA1c，其批內和批間變異系數CV均可以小于1%，結果精確，HbA1c檢測結果不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響，特別適合糖尿病人的監控。

4. 金標免疫滲濾法(金標法) 免疫滲濾法

操作較簡(jiǎn)便, 目前代表儀器有挪威NycoCardReaderII特種蛋白多功能全定量金標檢測儀。

5. 化學(xué)發(fā)光法

采用離子捕捉免疫分析法, 應用HbA1c抗原與HbA1c抗體反應原理, 聯(lián)以熒光標記物, 通過(guò)連接帶負電的多陰離子復合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經(jīng)過(guò)一系列徹底清洗等步驟后, 測定熒光強度變化率, 計算濃度。采用專(zhuān)用試劑包和免疫發(fā)光分析儀,其檢測系統易于規范和重復, 可減少操作技術(shù)誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內、批間變異系數小, 回收率高, 準確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。

6. 放射免疫法

優(yōu)點(diǎn): 精密度高、特異性強、快速、價(jià)格相對便宜, 可批量測試, 且不受各種干擾因素的影響。缺點(diǎn): 目前對制備高效價(jià)的抗體尚存在許多困難, 仍處于研究中, 未能形成商品化試劑盒。

HbA1c的特點(diǎn)

與血糖值相平行

血糖越高，糖化血紅蛋白就越高，所以能反映出血糖的控制水平。

生成緩慢

血糖是不斷波動(dòng)的，容易受到進(jìn)食和糖代謝等相關(guān)因素的影響，每次抽血檢測結果只能反映當時(shí)血糖的水平。由于糖化血紅蛋白是逐漸生成的，短暫的血糖升高（降低）不會(huì )引起糖化血紅蛋白的升高（降低），并且不受是否空腹、抽血時(shí)間、是否使用胰島素等因素影響，所以更能可靠地反映體內血糖水平。

生成后不易分解

糖化血紅蛋白非常穩定，不易分解，所以它雖然不能反映短時(shí)間內的血糖波動(dòng)，卻能更好的反映較長(cháng)時(shí)間的血糖控制效果，能反映采血前2~3個(gè)月內的平均血糖水平。

較少受血紅蛋白水平影響

糖化血紅蛋白是指其在總血紅蛋白中的比例，所以不受血紅蛋白水平的影響。

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