重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification reaction，RPA）
自20世紀90年代初以來(lái)，大量的等溫核酸擴增方法涌現，有基于核酸序列的擴增（NASBA，又稱(chēng)轉錄介導擴增，TMA）、信號介導的核糖核酸擴增技術(shù)（SMART）、解旋酶依賴(lài)性擴增（HDA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環(huán)擴增（RCA）、多重置換擴增（MDA）、環(huán)介導的等溫擴增（LAMP）和鏈置換擴增（SDA）。其中RPA反應條件溫和，擴增效率高，非常適合臨床快速診斷、食品檢測、疫情防控、工業(yè)應用、現場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測等應用。
1.簡(jiǎn)介
與PCR等溫擴增方法相比，RPA具有操作簡(jiǎn)單、反應速度快、對設備要求低等優(yōu)點(diǎn)。在靈敏度方面，RPA可以檢測最低水平樣品中的痕量核酸。在一些研究中，RPA甚至可以檢測到PCR無(wú)法檢測到的低濃度DNA。在特異性方面，RPA可以從不同物種和標本類(lèi)型的基因組DNA中識別和擴增靶基因。RPA抗干擾能力強，檢測結果可與PCR高度一致。此外，RPA可以在37-42°C下運行，無(wú)需復雜的溫度控制設備，非常適合資源匱乏環(huán)境下的現場(chǎng)檢測，并可以在20 min內得到檢測結果，有利于樣品的大規模篩選和快速檢測。
2.反應機理
重組酶聚合酶擴增技術(shù)通過(guò)模擬DNA體內擴增，在等溫條件下產(chǎn)生目的片段。該技術(shù)主要依賴(lài)重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。重組酶能夠不通過(guò)加熱就解開(kāi)雙鏈DNA。重組酶聚合酶擴增反應開(kāi)始時(shí)，重組酶在A(yíng)TP的參與下結合引物，形成核酸蛋白復合體，這些復合體能夠掃描與引物序列互補的目標雙鏈DNA。接著(zhù)，核酸蛋白復合體侵入5'端位點(diǎn)形成D狀環(huán)。單鏈結合蛋白與被置換單鏈結合使其穩定。同時(shí)，重組酶離開(kāi)寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，鏈置換DNA聚合酶結合在核酸蛋白復合體的游離3'端，進(jìn)行鏈延伸，形成新的互補鏈。在鏈延伸的過(guò)程中，新合成的單鏈與原始互補鏈配對。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現DNA的指數增長(cháng)。
Fig. 1 重組酶蛋白與每個(gè)引物形成復合物（A），掃描DNA的同源序列（B）。然后通過(guò)重組酶（C）的鏈置換活性將引物插入同源位點(diǎn)，單鏈結合蛋白穩定了置換的DNA鏈（D）。隨后重組酶分解，引物3'端可進(jìn)入置換DNA聚合酶（E）的鏈，從而延長(cháng)引物（F），通過(guò)循環(huán)重復該過(guò)程實(shí)現了指數放大。
3.RPA檢測的影響因素
RPA的突出之處源于其特定的反應成分和機理。RPA檢測的細微差別取決于內在因素（如引物、探針和核酸模板的設計），并與外在因素有關(guān)（如反應溫度和攪拌、對錯配的耐受性、抑制劑和背景DNA）。此外，RPA過(guò)程中的核酸標記、RPA擴增產(chǎn)物的清理和擴增后處理也是實(shí)現RPA檢測的重要細節。
3.1 RPA模板、引物、探針及其設計
RPA試驗中DNA模板的GC含量應在40%-60%之間，并且應避免長(cháng)同質(zhì)聚合物軌道、少量直接/反向重復和回文序列；引物GC含量應在30%-70%之間，5′端應避免鳥(niǎo)嘌呤長(cháng)跡，推薦胞苷類(lèi)；引物3′端推薦添加鳥(niǎo)嘌呤和胞苷，以提高性能。此外需要避免引物和探針之間的重疊，減少對擴增效率的影響。
- 模板
RPA最初被證明是一種DNA核酸擴增方法，后來(lái)發(fā)現通過(guò)添加逆轉錄酶，RNA 也可以作為模板。無(wú)論和核酸模板類(lèi)型如何，在試驗中推薦RPA擴增子長(cháng)度應低于500個(gè)核苷酸，大多數RPA擴增子長(cháng)度在100到250個(gè)核苷酸之間，在此區間內會(huì )產(chǎn)生快速有效的擴增。
- 引物
與PCR不同，RPA引物的長(cháng)度相對較長(cháng)（建議至少為30個(gè)核苷酸，但通常在32至35個(gè)核苷酸之間）。較短的PCR引物（通常在18到25個(gè)核苷酸之間）也可以用于RPA反應，但可能會(huì )降低反應速度和靈敏度。
- 探針
TaqMan等傳統探針不能用于RPA，PCR Taq聚合酶也與擴增系統不兼容，對于實(shí)時(shí)檢測通常使用2種探頭，RPA-exo或fpg。exo探針是一個(gè)長(cháng)寡核苷酸（46-52個(gè)堿基），帶有內部堿基類(lèi)似物（如四氫呋喃，THF），位于熒光基團和淬滅劑之間，具有封閉的3'末端。非堿性殘基用作酸外切酶的底物，只有在探針與靶序列結合后才能切割THF，熒光產(chǎn)生通常在RPA反應期間的5-10分鐘內產(chǎn)生可檢測的信號。與exo探針相比，fpg探針更短（32-35個(gè)堿基），它具有5′淬滅劑和下游5-6個(gè)堿基的熒光團，通過(guò)C-O-C接頭連接到非堿性核苷酸的核糖上。fpg是一種8-氧鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶，它識別并切割熒光團，同時(shí)留下2個(gè)不可延伸的序列，是與核酸外切酶不同的催化模式。
3.2 溫度和攪拌的影響
反應溫度和反應過(guò)程中的攪拌是兩個(gè)重要的外在影響因素。
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溫度
推薦的RPA反應溫度在37-42℃之間，但在低至25℃的溫度下，經(jīng)過(guò)RPA放大和隨后的側流條帶檢測，仍然可以產(chǎn)生正信號。此外，環(huán)境溫度對RPA反應也有影響，當環(huán)境溫度低于10℃時(shí)，RPA反應不穩定，但延長(cháng)反應時(shí)間可以提高陽(yáng)性結果的可得性。
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攪拌與震蕩
反應溫度為RPA中的酶提供了合適的工作環(huán)境，而攪拌則可以增加均質(zhì)溶液反應中RPA組分之間的相互作用。建議對RPA反應執行兩次混合步驟，一次在過(guò)程開(kāi)始時(shí)，另一次在反應4分鐘后。前者是混合所有RPA試劑來(lái)引發(fā)反應，后者是為了防止反應試劑局部耗盡，從而提高反應速率。
此外，在整個(gè)RPA反應過(guò)程中不斷震蕩混勻，可以進(jìn)一步加快RPA反應速度，特別是當模板濃度接近檢測極限時(shí)，可獲得更穩定的陽(yáng)性結果，提高靈敏度。
3.3 對錯配、抑制劑和背景DNA的耐受性
除了溫度和攪拌，對錯配、抑制劑和背景DNA的耐受性也是實(shí)現高效、靈敏RPA反應的重要因素。
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錯配
RPA具有耐錯配能力，引物5′端或中心的錯配只會(huì )輕微地影響RPA反應，由于聚合酶從3′端延伸引物和探針，所以位于3′端的錯配對反應有顯著(zhù)影響。然而，一般的RPA錯配容忍度（在引物3′端之外）可能是有利的，因為它針對高度多態(tài)的靶標引物設計提供一定的靈活性。在高度多態(tài)的靶標中，很難定位長(cháng)期保守的靶區，所以這種錯配耐受性的缺點(diǎn)是傾向于對密切相關(guān)的物種進(jìn)行非特異性檢測。
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抑制劑和背景DNA
在測試臨床或現場(chǎng)樣品時(shí)，可能會(huì )在樣品制備和處理時(shí)引入干擾物質(zhì)（如抑制劑），影響核酸擴增。研究表明RPA對一些聚合酶抑制物有耐受性，例如，當血紅蛋白（20gL-1）、肝素（0.5U）、尿液（1.25%)時(shí)對RPA反應無(wú)影響；但在十二烷基硫酸鈉（0.05%/v/v）和尿液（10%）存在下反應被完全抑制，同時(shí)在模板濃度接近檢測極限時(shí)，反應更容易受到抑制劑影響。除了對抑制劑的耐受性外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴增靶核酸。
4.RPA的應用
4.1 細菌檢測中的應用
基于RPA和側向流試紙條的雙重檢測生物傳感器來(lái)檢測霍亂弧菌和創(chuàng )傷弧菌。該生物傳感器具有靈敏度和特異性高、反應時(shí)間短、設備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，非常適合基層醫院和現場(chǎng)檢測。此外，用于檢測銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的重組酶聚合酶擴增結合側向流試紙條（RPA-LFS）也已經(jīng)過(guò)實(shí)驗驗證。
4.2 在真菌檢測中的應用
目前，醫學(xué)上主要通過(guò)形態(tài)和生理表型對真菌進(jìn)行檢測。此方法檢測時(shí)間長(cháng)，陽(yáng)性檢出率低。例如新型隱球菌是一種有條件的病原體，大多數患者有中樞神經(jīng)系統感染癥狀，死亡率高。檢測新型隱球菌的常用方法是墨水染色和病原體培養。培養法是檢測的金標準，但培養時(shí)間長(cháng)不利于臨床快速診斷。墨跡染色法受試樣類(lèi)型限制，陽(yáng)性檢出率低?；谶@種情況建立了用于目視快速檢測新型隱球菌/格特隱球菌的RPA-LFS。
4.3 在病毒檢測中的應用
逆轉錄重組酶聚合酶擴增（RT-RPA）和RPA-LFS方法比RPA-CRISPR更早應用，也廣泛用于病毒檢測。RPA-LFS還可以聯(lián)合檢測流行性出血性疾病病毒、血清型病毒和呼吸道合胞病毒。由于一些病毒（如胡椒黃斑病毒）在其復制周期中具有兩個(gè)階段的DNA和RNA，建立了RPA和RT-RPA來(lái)檢測病毒。RPA在病毒檢測中的應用往往首先需要逆轉錄。如果將逆轉錄和RPA擴增分為兩個(gè)步驟，則氣溶膠產(chǎn)生和污染的風(fēng)險增加。
4.4 在寄生蟲(chóng)檢測中的應用
RPA和實(shí)時(shí)熒光的結合允許實(shí)時(shí)檢測過(guò)程，并且比RPA-LFS具有更低的交叉污染風(fēng)險。RT-RPA還可以針對不同寄生蟲(chóng)的特定基因設計引物探針，以建立多個(gè)RT-RPA。目前多個(gè)RT-RPA已成功應用于同時(shí)快速檢測馬泰勒氏菌和卡巴利巴貝蟲(chóng)。除了傳統的熒光探針外，熒光染料SYBR Green I與RPA相結合也常用于檢測寄生蟲(chóng)，例如諾氏瘧原蟲(chóng)。RPA已成功應用于檢測許多寄生蟲(chóng)，但應用尚未廣泛。目前的研究大多是相對簡(jiǎn)單的RPA-LFS、實(shí)時(shí)熒光RPA等，RPA與其他方法相結合的進(jìn)一步研究相對較少。
4.5 在耐藥基因檢測中的應用
抗生素的過(guò)度使用會(huì )導致細菌耐藥，給臨床疾病的診斷和治療帶來(lái)巨大挑戰。細菌耐藥監測對指導臨床用藥、避免或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義，RPA的快速、高效、簡(jiǎn)單優(yōu)勢在抗性基因檢測中發(fā)揮著(zhù)重要作用。RPA具有與PCR相當的檢測能力，有時(shí)其靈敏度甚至高于PCR。
4.6 在轉基因食品檢測中的應用
目前，基于蛋白質(zhì)水平和核酸水平檢測轉基因作物的方法主要有兩種。前者受蛋白質(zhì)變性、檢測試劑等原因的限制，無(wú)法滿(mǎn)足大規模轉基因作物的檢測。后者的PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，但PCR需要復雜且昂貴的熱循環(huán)儀器，操作流程復雜，不適合現場(chǎng)檢測。建立快速便捷的檢測方法將大大提高轉基因食品的檢測效率。RPA方便高效，非常適合基層單位、倉庫、田間現場(chǎng)轉基因檢測。然而，只有少數公司銷(xiāo)售RPA試劑，這限制了其在轉基因食品大規模篩選中的應用。
4.7 在SARS-CoV-2檢測中的應用
當前檢測SARS-CoV-2的主要方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、數字PCR和各種等溫擴增方法。其中，RT-qPCR是應用最廣泛的方法，但對設備、檢測條件、人員操作要求較高。通過(guò)將RPA和LFS檢測系統集成到單個(gè)微流控芯片中，建立了用于快速檢測SARS-CoV-2的微流控集成側流RPA。封閉的微流控芯片克服了氣溶膠污染，簡(jiǎn)便的分析系統降低了設備成本和人工成本。RPA還可以通過(guò)添加熒光染料SYBR Green I實(shí)時(shí)或在終點(diǎn)檢測SARS-CoV-2，不需要打開(kāi)管子，避免氣溶膠污染，并可用肉眼觀(guān)察測試結果，且成本也低于RPA-LFS和RT-RPA。RPA對設備和現場(chǎng)檢測環(huán)境要求較低，非常適合SARS-CoV-2的現場(chǎng)篩查。
參考文獻
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相關(guān)產(chǎn)品
蘇公網(wǎng)安備32011202001302